Influence de la consommation de raisin sur le microbiome humain

May 12, 2023

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7706 (2023) Citer cet article

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Au fil des ans, un ensemble substantiel d'informations s'est accumulé suggérant que la consommation alimentaire de raisins pourrait avoir une influence positive sur la santé humaine. Ici, nous étudions le potentiel des raisins à moduler le microbiome humain. La composition du microbiome ainsi que les métabolites urinaires et plasmatiques ont été évalués de manière séquentielle chez 29 sujets sains libres de sexe masculin (24 à 55 ans) et féminins (29 à 53 ans) après deux semaines de régime restreint (Jour 15), deux semaines de régime restreint avec consommation de raisin (équivalent à trois portions par jour) (Jour 30) et quatre semaines de régime restreint sans consommation de raisin (Jour 60). Sur la base des indices de diversité alpha, la consommation de raisin n'a pas modifié la composition globale de la communauté microbienne, sauf avec le sous-ensemble féminin basé sur l'indice de Chao. De même, sur la base des analyses de la diversité bêta, la diversité des espèces n'a pas été significativement modifiée aux trois moments de l'étude. Cependant, après 2 semaines de consommation de raisin, l'abondance taxonomique a été altérée (par exemple, diminution de Holdemania spp. et augmentation de Streptococcus thermophiles), ainsi que divers niveaux d'enzymes et voies KEGG. De plus, des changements taxonomiques, enzymatiques et de voie ont été observés 30 jours après la fin de la consommation de raisin, dont certains sont revenus à la ligne de base et dont certains suggèrent un effet retardé de la consommation de raisin. Les analyses métabolomiques ont confirmé la signification fonctionnelle de ces altérations dans lesquelles, par exemple, l'acide 2′-désoxyribonique, l'acide glutaconique et l'acide 3-hydroxyphénylacétique ont été élevés après la consommation de raisin et sont revenus à la ligne de base après la période de lavage. La variation interindividuelle a été observée et illustrée par l'analyse d'un sous-groupe de la population étudiée montrant des modèles uniques de distribution taxonomique au cours de la période d'étude. Les ramifications biologiques de ces dynamiques restent à définir. Cependant, bien qu'il semble clair que la consommation de raisin ne perturbe pas l'état eubiotique du microbiome chez des sujets humains normaux et en bonne santé, il est probable que les changements dans les réseaux interactifs complexes résultant de la consommation de raisin aient une signification physiologique pertinente pour l'action du raisin.

L'influence potentielle du microbiome humain, composé de plus de 3 millions de gènes et de l'ordre de 1014 micro-organismes1, sur la santé et le bien-être est profonde. Au cours des deux dernières décennies, des progrès remarquables dans la recherche sur le microbiome ont fourni les outils et les connaissances nécessaires pour permettre une enquête significative sur l'influence de ce "tissu" sur la santé et la maladie humaines (cf.2). Des mots tels que prébiotique, probiotique, symbiotique, eubiose et dysbiose sont maintenant couramment incorporés dans le lexique ordinaire du grand public et de la communauté scientifique. Le marché est devenu une industrie de plusieurs milliards de dollars, avec une croissance substantielle prévue à l'avenir, grâce à la fourniture de produits conçus pour les humains ainsi que d'autres mammifères.

Étant donné qu'il est généralement admis que le maintien d'un microbiote intestinal "sain" est important pour la santé humaine, l'impact potentiel de l'alimentation a été largement étudié3. Ainsi, la modulation de la composition du microbiome ainsi que les niveaux de métabolites générés par le microbiome (tels que l'acétate, le propionate et le butyrate), par la consommation alimentaire de protéines, glucides, lipides, polyphénols, phytoestrogènes, etc., ont été décrits4.

Un domaine qui nous intéresse est l'influence potentielle du raisin sur la santé. La consommation alimentaire est répandue, comme en témoigne la production de plus de 6 millions de tonnes par an aux États-Unis seulement. Sur la base d'essais cliniques humains ou d'études menées avec des modèles animaux, les résultats ont suggéré un éventail de réponses médiées par le raisin sur l'athérosclérose, l'inflammation, le cancer, la santé gastro-intestinale, les effets sur le SNC, l'arthrose, la fonction de la vessie et la vision5.

Récemment, en utilisant des modèles de souris alimentés en raisins alimentaires, nous avons montré des effets remarquables sur l'expression des gènes, la prévention ou le retard de la stéatose hépatique et l'amélioration de la durée de vie6, ainsi que des effets sur la cognition et l'expression des gènes dans le cerveau7. Bien qu'un constituant chimique important du raisin soit le resvératrol, dont le potentiel biologique a été largement étudié8, seules de petites quantités de cette substance sont fournies par l'alimentation humaine normale. De plus, le raisin est connu pour contenir plus de 1600 constituants phytochimiques9, dont beaucoup seuls ou en combinaison peuvent être capables de médier une réponse. En tant que tel, dans le contexte de l'alimentation et de la santé, il est de la plus haute importance de considérer le raisin comme un aliment complet.

Compte tenu du large éventail d'actions associées à la consommation de raisin, nous avons entrepris d'explorer l'influence potentielle sur le microbiome humain en tant que sous-jacent mécaniste possible. Dans des travaux antérieurs, le traitement du microbiote intestinal humain avec des polyphénols totaux de pépins de raisin a entraîné une modification des profils des acides gras à chaîne courte (AGCC) et des populations microbiennes concernées10. Avec des souris recevant un régime riche en graisses complété par de la poudre de raisin enrichie, l'abondance des gènes qui régulent la production microbienne de butyrate a été sélectivement augmentée11. Dans notre travail murin, l'excrétion urinaire des métabolites du microbiote intestinal acide 4-hydroxyphénylacétique, 5-hydroxyindole, acide glycérique, acide gluconique et myo-inositol était atténuée lorsque le raisin était ajouté à un régime standard, et les métabolites du microbiote intestinal acide gluconique, scyllo-inositol, mannitol, xylitol, 5-hydroxyindole et acide 2′-désoxyribonique étaient augmentés chez urine lorsque le raisin a été ajouté à un régime riche en graisses12,13,14. De plus, dans une étude d'intervention humaine en deux phases (phase de normalisation de 4 semaines et phase d'intervention sur le raisin de 4 semaines), Yang et al. ont observé une augmentation de l'indice de diversité alpha du microbiome intestinal (indice de Shannon), ainsi qu'une diminution du cholestérol total et des acides biliaires totaux15.

En utilisant un protocole alternatif et un plus grand nombre de sujets, nous rapportons actuellement un essai sur l'homme dans lequel des volontaires normaux vivant librement ont consommé l'équivalent de trois portions de raisins par jour pendant deux semaines, suivies d'une période de sevrage d'un mois. La composition résultante du microbiome intestinal a été évaluée par analyse fécale. De plus, une évaluation des métabolites dans l'urine et le plasma a été effectuée.

L'essai s'est déroulé sur une période de deux mois. Quarante sujets humains normaux, en bonne santé et vivant librement ont participé à l'essai au cours duquel du plasma, de l'urine et des matières fécales ont été prélevés séquentiellement après deux semaines de régime restreint (jour 15), deux semaines de régime restreint complété par l'équivalent de trois portions de raisins par jour (jour 30) et une période de sevrage d'un mois (jour 60). Aucun événement indésirable n'est survenu pendant toute la durée de l'étude. Vingt-neuf sujets ont terminé toutes les phases de l'essai.

La diversité alpha a été étudiée pour évaluer la richesse (nombre) ou la régularité (abondance relative) du microbiome de la population étudiée aux jours 15, 30 et 60 (supplément 1). Avec les 29 sujets pris ensemble pour l'analyse, aucune différence n'a été trouvée dans les indices de diversité OTU, Chao1 ou Shannon. De même, aucune altération n'a été observée chez les hommes inclus dans le groupe d'étude, âgés de 24 à 44 ans. Cependant, avec les femmes du groupe d'étude, âgées de 29 à 39 ans, une différence a été observée au jour 30 (après deux semaines de consommation de raisin) où la taille de l'effet d de Cohen pour le test de Chao était de 0,836 et la valeur p était de 0,114 (test t apparié de Student). Une différence a également été observée lors de la comparaison de la ligne de base (Jour 15) avec la période de sevrage (60e jour) (Cohen d de 0,982 et une valeur P de 0,079).

La diversité bêta évaluée par la dissemblance Bray-Curtis a été calculée et visualisée via des analyses en composantes principales (PCA) et des analyses de coordonnées principales (PCoA) (supplément 2). Selon les analyses par grappes (intervalles de confiance à 95 %), aucune différence significative n'a été observée aux jours 15, 30 ou 60 lorsque la population à l'étude a été évaluée dans son ensemble ou divisée en groupes composés uniquement d'hommes ou de femmes uniquement.

Les espèces microbiennes trouvées dans les échantillons des 29 sujets aux jours 15, 30 et 60 sont présentées sur la figure 1A. Les espèces les plus abondantes présentes dans le microbiote intestinal sont Faecalibacterium prausnitzii, Prevotella copri, Bacteroides stercoris, Alistipes putredinis, Bifidobacterium adolescentis, Eubacterium rectale, Fusicatenibacter saccharivorans, Bacteroides vulgatus, Alistipes finegoldii, Akkermansia muciniphila, Collinsella aerofaciens, Bacteroides uniformis, Bacteroides coprocola et Parabacteroides merdae. Comme on peut le voir en comparant les barres de triplet de la figure 1A, chaque point dans le temps avec chaque individu montre un profil différent suggérant un changement induit par le protocole alimentaire. Un aperçu de la variation individuelle de la diversité de toutes les espèces aux jours 15, 30 et 60 peut être visualisé par les graphiques en aires illustrés à la Fig. 1B, et les transitions de la composition microbienne du jour 15 au jour 30, du jour 15 au jour 60 et du jour 15 au 60, sont évidents à partir des superpositions des graphiques en aire illustrés dans le supplément 3, Fig. S1.

Cartes représentant la diversité des espèces. (A) Les parcelles empilées présentent la diversité de toutes les espèces chez les sujets individuels de 1 à 29. (B) Les graphiques en aires montrent la diversité des espèces parmi les 29 sujets aux jours 15, 30 et 60.

Des analyses taxonomiques microbiennes comparatives pour l'ensemble de la population de sujets pour le jour 15 contre 30, le jour 30 contre 60 et le jour 15 contre 60 sont présentées dans les tableaux 1, 2, 3, respectivement. Les sélections incluses dans les tableaux ont été considérées comme étant celles qui sont le plus influencées par le statut alimentaire sur la base de valeurs p fortes ainsi que de valeurs d Cohen indiquant une taille d'effet dans la plage moyenne à large. La hiérarchie taxonomique est désignée ainsi qu'une brève connotation fonctionnelle pour chaque entrée.

Pour chaque comparaison, des altérations significatives du microbiome ont été observées. Notamment, après la consommation de raisin (jour 30), Streptococcus thermophiles, considéré comme un probiotique qui produit de l'acide lactique dans l'intestin, était élevé. D'autre part, Holdemania spp., ont été réduits, comme cela se produit chez ceux qui suivent un régime végétarien. Fait intéressant, 30 jours après la consommation de raisins, l'abondance de Holdemania a augmenté et aucun changement n'a été noté chez Streptococcus thermophiles. En comparant le point de temps de 30 jours au point de temps de 60 jours, des augmentations constantes de l'abondance d'organismes associés à la production de métabolites tels que les acides gras à chaîne courte ont été notées. Cela tend à suggérer une réponse retardée à la consommation de raisin, puisque ces changements n'ont pas été observés dans les comparaisons du jour 15 contre 30 ou du jour 15 contre 60.

Comme ci-dessus, une comparaison de l'abondance enzymatique associée au microbiome a été effectuée pour le jour 15 vs 30, le jour 30 vs 60 et le jour 15 vs 60. Les résultats sont présentés dans les tableaux 4, 5 et 6, respectivement. Encore une fois, les entrées ont été sélectionnées sur la base de valeurs p fortes ainsi que de valeurs d Cohen indiquant une taille d'effet dans la gamme moyenne à large.

Le plus petit nombre d'entrées se trouve dans le tableau 4, lorsque l'on compare le jour 15 au jour 30. Notamment, cependant, la catéchol 2,3-dioxygénase, qui peut être considérée comme ayant une valeur dans la détoxification métabolique29, était élevée. D'autre part, la (3S)-malyl-CoA thioestérase a été réduite, ce qui peut avoir un effet sur le cycle glyoxylate des micro-organismes.

En comparant le jour 15 avec les jours 30 et 60, un changement notable est l'élévation de l'ADN polymérase sujette aux erreurs, qui a la capacité de se répliquer par des dommages à l'ADN30. Comme ci-dessus, les niveaux d'enzymes qui sont modifiés sur la liste du jour 30 par rapport au jour 60, mais qui n'apparaissent pas sur la liste du jour 15 par rapport au jour 30, peuvent être dus à un effet retardé de la consommation de raisin.

Enfin, une comparaison des voies KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (niveau 3) associées au microbiome a été étudiée pour le jour 15 vs 30, le jour 30 vs 60 et le jour 15 vs 60. Les résultats sont présentés dans les tableaux 7, 8 et 9, respectivement. Encore une fois, les entrées ont été sélectionnées sur la base de valeurs p fortes ainsi que de valeurs d Cohen indiquant une taille d'effet dans la gamme moyenne à large. Un nombre relativement faible d'altérations de la voie a été observé.

La comparaison entre le jour 30 et le jour 15 indique une amélioration des « peptidases à cystéine » qui jouent un rôle clé dans l'hydrolyse de l'hémoglobine, l'invasion des cellules sanguines, la sortie et le traitement des protéines de surface31, les « transporteurs ABC » améliorés et réduits, qui participent au mouvement des métabolites vers la surface cellulaire32, et la réduction de la « famille Narl », qui est une voie de transduction sensorielle33.

En comparant le jour 60 et le jour 30, cela révèle l'amélioration des "oxydoréductases" (une large classe d'enzymes catalysant le transfert d'électrons34), des "transporteurs ABC", de la "nonribosomal peptide synthetase (NRPS)" (catalyse la synthèse de produits peptidiques importants à partir d'une variété de substrats d'acides aminés standard et non protéinogènes35) et des "peptidases aspartiques" (processus métaboliques importants dans les micro-organismes36).

Dans la comparaison entre le jour 60 et le jour 15, les "voies ABC" sont à nouveau réduites et l'amélioration des "NRPS" et des "oxydoréductases" est conservée. L'altération la plus importante trouvée dans l'ensemble de cet ensemble de données est l'amélioration du "photosystème anoxygénique" au cours de cette période. Ceci est quelque peu surprenant étant donné que les bactéries phototrophes anoxygéniques sont connues pour leur croissance en utilisant l'énergie de la lumière sans dégagement d'oxygène. Cependant, certains organismes sont connus pour se développer de manière aérobie dans l'obscurité et effectuer une bioremédiation des colorants récalcitrants, des pesticides et des métaux lourds dans des conditions anaérobies37.

Le tracé des scores PLS-DA pour le jour 15 par rapport au jour 30 est illustré à la Fig. 2A. Comme on peut le voir, il y a très peu de différence entre les scores des plasmas du jour 15 (vert) et du jour 30 (bleu), avec une tendance du jour 30 à se déplacer vers le quadrant supérieur droit. Le tracé des scores OPLS-DA pour le jour 15 par rapport au jour 30 est illustré à la Fig. 2B. Ici, il y a une légère tendance pour les échantillons du jour 15 à se regrouper vers la gauche et les échantillons du jour 30 à se regrouper vers la droite. Cependant, il n'y a manifestement aucune séparation entre les deux moments.

(A) Graphique des scores PLS-DA pour le plasma du jour 15 (vert) par rapport au plasma du jour 30 (bleu), (B) Graphique des scores OPLS-DA pour le plasma du jour 15 (vert) par rapport au plasma du jour 30 (bleu) et (C) Charges OPLS-DA S-plot pour le plasma du jour 15 par rapport au plasma du jour 30. 1, acide stéarique ; 2, acide glucuronique.

Le diagramme en S des chargements OPLS-DA affiche la distribution des 59 métabolites plasmatiques identifiés (Fig. 2C). Les métabolites élevés et déprimés ont tous été criblés à l'aide d'une analyse univariée par paires pour les différences significatives entre les deux jours d'étude. Seuls deux métabolites plasmatiques se sont avérés statistiquement significativement modifiés entre le régime restreint (Jour 15) et le régime de raisin (Jour 30). L'acide stéarique était élevé de 10 % (P < 0,05) et l'acide β-d-glucuronique était déprimé de 17 % (p = 0,003) dans le plasma.

Le tracé des scores PLS-DA pour le jour 30 par rapport au jour 60 est illustré à la figure 3A. Par rapport à l'analyse du jour 15 et du jour 30, il y a une séparation légèrement meilleure des scores entre les échantillons du jour 30 et les échantillons du jour 60, avec une tendance du jour 30 vers la gauche et du jour 60 vers la droite. Lorsqu'un modèle OPLS-DA a été généré (Fig. 3B), la séparation est apparue légèrement meilleure. Cela se reflétait dans le tracé en S des charges OPLS-DA (Fig. 3C), où quatre métabolites étaient élevés dans le plasma au jour 60 et un déprimé. Fait intéressant, trois sucres ont été élevés après le passage du régime à base de raisin au régime restreint : le glucose (+ 11 %, p = 0,007), le mannose (+ 16 %, p = 0,03) et le fructose (+ 17 %, p = 0,008), ainsi que l'acide 2-hydroxybutanoïque (+ 7 %, p = 0,01). Un métabolite a été déprimé dans le plasma après le retour du raisin au régime restreint - l'acide lactique (− 17 %, p = 0,02).

(A) Graphique des scores PLS-DA pour le plasma du jour 60 (bleu) par rapport au plasma du jour 30 (vert); (B) Graphique des scores OPLS-DA pour le plasma du jour 60 (bleu) par rapport au plasma du jour 30 (vert); (C) Charges OPLS-DA S-plot pour le plasma du jour 30 par rapport au plasma du jour 60. 1, glycémie ; 2, mannose; 3, fructose ; acide 4,2-hydroxybutanoïque; 5, acide lactique.

Le tracé des scores PLS-DA pour l'urine du jour 15 par rapport à l'urine du jour 30 est illustré à la figure 4A. Dans ce graphique des scores, une séparation entre les urines du jour 15 et du jour 30 apparaît. Lorsque cela a été examiné plus en détail à l'aide d'un modèle OPLS-DA (Fig. 4B), la même différence émergente entre les urines de régime restreint et de raisin a été observée. Le diagramme en S des charges OPLS-DA (Fig. 4C) a révélé quatre métabolites urinaires élevés et dix métabolites diminués. Ces différences étaient plus profondes que celles observées dans les échantillons de plasma comparatifs.

(A) Graphique des scores PLS-DA pour l'urine du jour 15 (vert) par rapport à l'urine du jour 30 (bleu); (B) Graphique des scores OPLS-DA pour l'urine du jour 15 (vert) par rapport à l'urine du jour 30 (bleu); (C) Charges OPLS-DA S-plot pour l'urine du jour 15 par rapport à l'urine du jour 30. 1, acide tartrique ; Acide 2, 2′-désoxyribonique; 3, acide glutaconique ; acide 4,3-hydroxyphénylacétique; 5, Valine ; acide 6,3-indoleacétique; 7, Ribose ; acide 8,2,3-dihydroxybutanoïque; 9, Galactose ; 10, glucose ; 11, acide hippurique ; 12, acide carbamique ; 13, acide malonique ; 14, Levoglucosan.

Le tracé des scores PLS-DA pour l'urine du jour 30 par rapport à l'urine du jour 60 est illustré à la Fig. 5A. Les urines de régime restreint et de raisin sont presque complètement séparées dans le tracé des scores PLS-DA, et une amélioration continue a été réalisée lorsque le modèle OPLS-DA a été appliqué (Fig. 5B). Comme le montre le graphique en S des charges OPLS-DA (Fig. 5C), un métabolite urinaire a été élevé par le retour au régime restreint et cinq métabolites ont été diminués.

Graphique des scores PLS-DA pour l'urine du jour 30 (verte) par rapport à l'urine du jour 60 (bleue) (A); Graphique des scores OPLS-DA pour l'urine du jour 30 (verte) par rapport à l'urine du jour 60 (bleue) (B) ; Charges OPLS-DA S-plot pour l'urine du jour 30 par rapport à l'urine du jour 60. 1, acide tartrique ; Acide 2, 2′-désoxyribonique; 3, acide glutaconique ; 4, acide ribonique ; acide 5,3-hydroxyphénylacétique; 6, acide fumarique (C).

Enfin, nous avons pensé qu'il serait intéressant de séparer un groupe de sujets présentant les changements de profil uniques les plus évidents en fonction du genre et de l'espèce bactériens, et de comparer ces sujets avec le reste de la population étudiée. En conséquence, 11 sujets ont été sélectionnés démontrant les changements de profil illustrés à la Fig. 6.

Sélection arbitraire de 11 sujets basée sur des changements de profil uniques du genre (A) et de l'espèce (B).

Comme prévu, sur la base de la méthode de sélection de ces 11 sujets, la comparaison de la diversité alpha (Supplément 1, Fig. S1D) et de la diversité bêta (Supplément 2, Fig. S1D) avec les 18 sujets restants n'a révélé aucune différence significative. Cependant, comme résumé dans le supplément 3, la comparaison du jour 15 au jour 30 et du jour 15 au jour 60, de ces 11 sujets avec les 18 sujets restants, a révélé des différences significatives en termes de comparaisons taxonomiques, enzymatiques et des voies KEGG. Par exemple, dans la comparaison de 15 à 60 jours, l'abondance d'Erysipelotrichia, d'Erysipelotrichales, d'Erysipelotrichaceae et de Ruminococcus a été modifiée (supplément 3, tableau S1), de même que trois voies KEGG (supplément 3, tableau S2) et 13 enzymes (supplément 3, tableau S3).

La comparaison du jour 30 et du jour 60 (supplément 3, tableau S4) a révélé que les taxons suivants étaient significativement différents - classe : Coriobacteriia (métabolisme des acides biliaires38), ordre : Coriobacteriales (métabolisme des acides biliaires39), famille : Coriobacteriaceae (métabolisme des acides biliaires40), genre : Collinsella (Collinsella a été associée à une dysbiose pro-inflammatoire dans le diabète de type 2 et à l'insuline circulante suggérant un mécanisme de promotion de la pathologie NAFLD41), espèce : Collinsella aerofaciens (C. aerofaciens est le principal utilisateur de lactose dans le côlon humain. Plusieurs études ont démontré que Collinsella et Bifidobacterium peuvent modifier les acides biliaires de l'hôte pour moduler la virulence et la pathogénicité des pathogènes entériques42). De même, plusieurs différences significatives ont été observées dans les comparaisons des enzymes et des voies KEGG entre le jour 30 et le jour 60 (supplément 3, tableaux S6 et S7).

La rupture dans la variation de l'abondance taxonomique était moins profonde dans la comparaison entre le jour 15 et le jour 60 des sujets sélectionnés avec le reste du groupe (supplément 3, tableau S7). Cependant, de nombreuses différences significatives ont été observées dans les niveaux d'enzymes (supplément 3, tableau S8) et les voies KEGG (supplément 3, tableau S9).

Enfin, des analyses métabolomiques comparatives des deux sous-groupes ont été étudiées avec OPLS-DA au jour 30 (après la consommation de raisin). Comme le montre la figure 7, le groupe sélectionné de 11 sujets peut être distingué des 18 sujets restants sur la base des tracés des scores OPLS-DA, avec des échantillons d'urine et de plasma. Cependant, les analyses univariées des données des métabolites plasmatiques et urinaires jugés provenir du microbiote n'ont pas montré de grande différence entre les deux groupes, mis à part le myo-inositol dans le plasma, qui était quelque peu diminué (p = 0,03) (supplément 4).

Échantillon de plasma OPLS-DA note les tracés du groupe sélectionné de 11 sujets (rouge) par rapport aux 18 sujets restants (vert) déterminés avec des échantillons de plasma (A) et d'urine (B).

Alors que le microbiome intestinal d'un individu en bonne santé est relativement stable, la dysbiose peut entraîner ou être associée à des problèmes de santé tels que la maladie de Crohn, les maladies auto-immunes, le cancer du côlon, les ulcères gastriques, les maladies cardiovasculaires et l'obésité. Dans la présente étude, les sujets humains variaient selon le sexe et l'âge, mais tous étaient jugés en bonne santé. On s'attendait donc à ce que ces individus commencent l'étude dans un état eubiotique, c'est-à-dire avec un équilibre entre bactéries bénéfiques et nuisibles. Ainsi, notre objectif n'était pas orienté vers l'induction d'une altération particulière. Notre objectif était simplement de déterminer si la consommation d'un fruit alimentaire commun, c'est-à-dire le raisin, fonctionnait comme un prébiotique, un probiotique ou un antibiotique, ou, en fait, n'entraînait aucun changement majeur. Ce faisant, après une période de deux semaines sur un régime alimentaire contrôlé, le régime a été complété pendant une période de deux semaines au cours de laquelle un substitut de raisin bien défini équivalent à trois portions normales a été consommé quotidiennement, et enfin, une période de sevrage d'un mois au cours de laquelle le régime alimentaire contrôlé a été poursuivi mais la supplémentation en raisin a été interrompue. Des échantillons fécaux ont été prélevés pour analyse à chacun de ces trois moments.

Nous avons d'abord examiné la diversité alpha en tant qu'indication générale de la richesse (nombre) ou de la régularité (abondance relative) de l'ensemble de la population étudiée. Il n'y avait aucune différence perceptible entre les populations aux jours 15, 30 ou 60 (supplément 1, Fig. S1A). Étant donné que la diversité alpha peut varier selon le sexe et l'âge43, nous avons séparé nos sujets en cohortes et répété l'analyse. Encore une fois, aucune différence majeure n'a été observée aux différents moments, autres que chez les femmes, de l'âge de 29 à 39 ans, en comparant la ligne de base au jour 30 (15 jours de consommation de raisins) où la valeur D de Cohen pour le test de Chao était de 0,836 et la valeur p était de 0,114 (test t apparié de Student), et en comparant la ligne de base (jour 15) avec la période de sevrage (jour 60), où la valeur D de Cohen était de 0,982 avec une valeur p correspondante de 0,079 (Supplément 1, Fig. S1B). Cette différence n'a pas été observée chez les sujets masculins (Supplément 1, Fig. S1C), et il n'y avait pas non plus de différence lors de la comparaison du jour 30 et du jour 60 du groupe féminin (test de Chao ; valeur D de Cohen 0,047 et p = 0,93, test t apparié de Student).

Il est intéressant de noter que la diversité alpha des femelles présentant un changement après la consommation de raisin n'est pas revenue à la valeur de référence après la période de sevrage de 30 jours. Les ramifications de ce changement, le cas échéant, méritent une enquête plus approfondie. Nous notons que Yang et al.15 ont signalé un changement significatif de l'indice de Shannon lorsque 19 sujets humains ont reçu le substitut de raisin utilisé ici pendant une période de 4 semaines. Le sexe des sujets inscrits à cette étude n'a pas été précisé, bien qu'il ait été indiqué que la tranche d'âge était de 18 à 55 ans et que les femmes ménopausées étaient exclues. Nous notons également qu'une meilleure qualité alimentaire peut se refléter dans une plus grande diversité du microbiote intestinal44, comme cela a été observé avec le groupe féminin de notre étude.

Ensuite, nous avons étudié la diversité bêta, la similitude ou la dissemblance, aux jours 15, 30 et 60. La dissemblance Bray-Curtis a été calculée et visualisée via PCA et PCoA. Comme illustré dans le Supplément 2, aucune différence majeure n'a été observée avec la population étudiée avant, pendant ou après la consommation de raisin. Cela était vrai pour la population étudiée dans son ensemble, ainsi que pour les subdivisions basées sur le sexe.

Ainsi, sur la base des analyses de diversité alpha et bêta, nous concluons que la consommation de raisin en soi ne modifie pas les relations communautaires globales du microbiote avec cette population d'étude. Contrairement aux études animales contrôlées ou in vitro, il existe une variation interindividuelle significative lors de l'examen d'êtres humains vivant en liberté. Ceci est illustré par la comparaison de la première des barres de triplet représentée sur la figure 1A (jour 15) et par les superpositions composites illustrées sur la figure 1B. Après la période d'intervention du raisin (jour 30), la comparaison des deux premières barres de la figure 1A (jour 15 par rapport au jour 30) suggère des changements dans pratiquement tous les cas, comme on peut le visualiser plus en détail en comparant les superpositions composites des jours correspondants (Fig. 1B). Sur la base de la conception de l'étude, le facteur le plus susceptible d'entraîner ces changements était l'administration de raisins alimentaires pendant 2 semaines. Les barres finales des triplets illustrent l'état du microbiote après l'arrêt de l'administration du raisin, tout comme la troisième superposition. La question abordée par ce dernier point dans le temps était de savoir si le modèle reviendrait à cette administration de raisin précédente, ou si des changements seraient perpétués. La réponse semble résider chez l'individu.

Tout d'abord, il est clair que l'abondance des composants du microbiote change en fait avec l'intervention alimentaire du raisin, comme on peut le percevoir à partir des superpositions composites aux différents moments (supplément 3, Fig. S1). Des différences existent entre les trois points dans le temps. Un examen plus granulaire avec des sujets sélectionnés est illustré à la Fig. 6. Ce que nous pouvons tirer de ces exemples, c'est qu'un changement dans le microbiome induit par la consommation de raisin peut être durable, comme le montrent les sujets 1, 9 et 13, peut revenir à la ligne de base de 15 jours, comme le montrent les sujets 21 et 32, ne montrent aucun changement manifeste (sujets 3 et 28), ou quelque chose entre les deux.

Des analyses comparatives de la taxonomie de l'ensemble de la population étudiée ont indiqué des changements significatifs dans l'abondance microbienne lors de la comparaison du jour 15 au jour 30 (tableau 1), du jour 30 au jour 60 (tableau 2) et du jour 15 au jour 30 (tableau 3). Des changements correspondants dans les niveaux d'enzymes (tableaux 4, 5, 6) et les voies KEGG (tableaux 7, 8, 9) ont été associés aux changements taxonomiques à chaque comparaison de temps. Pour tenter de déchiffrer les conséquences physiologiques de ces effets, des analyses métabolomiques ont été effectuées avec des échantillons de plasma et d'urine fournis par la population de sujets à chaque instant pour l'étude des métabolites considérés comme associés au microbiome.

Avec le plasma, le tracé des scores PLS-DA pour le jour 15 par rapport au jour 30 a montré peu de différence (Fig. 2A). De même, le graphique des scores OPLS-DA n'a révélé aucune séparation claire entre les deux points dans le temps (Fig. 2B). Conformément à cela, le diagramme en S des charges OPLS-DA affichait la distribution des 59 métabolites plasmatiques identifiés (Fig. 2C), mais seuls deux [acide stéarique élevé à 10 % (P < 0,05) et acide β-d-glucuronique déprimé à 17 % (p = 0,003)] présentaient des changements statistiquement significatifs.

Lors de la comparaison entre le jour 30 et le jour 60, par rapport à la comparaison entre le jour 15 et le jour 30, une séparation légèrement meilleure a été observée dans le graphique des scores PLS-DA (Fig. 3A), qui a été quelque peu améliorée par la génération d'un modèle OPLS-DA (Fig. 3B). Comme le montre le graphique en S des charges OPLS-DA (Fig. 3C), trois sucres ont été élevés après le passage du régime de raisin au régime restreint [glucose (+ 11%, p = 0, 007), mannose (+ 16%, p = 0, 03) et fructose (+ 17%, p = 0, 008)], ainsi que l'acide 2-hydroxybutanoïque (+ 7%, p = 0, 01). L'acide lactique a été déprimé dans le plasma après le retour du raisin au régime restreint (− 17 %, p = 0,02).

L'augmentation du glucose, du mannose et du fructose après l'arrêt du raisin pendant la période de sevrage après l'arrêt du raisin est en corrélation avec le potentiel de la consommation de raisin à être bénéfique dans le syndrome métabolique, comme indiqué dans la littérature45,46. Conformément à cette suggestion, nous avons signalé que l'ajout de raisins à la fois à un régime standard et à un régime riche en graisses chez la souris est associé à une régulation à la hausse de la navette malate-aspartate et donc à l'efficacité de l'utilisation du glucose par le foie. De plus, l'acide 2-hydroxybutanoïque est principalement produit dans le foie lors de la synthèse du glutathion, dont nous avons également signalé qu'il était élevé par rapport à un régime à base de raisin chez la souris6.

L'analyse de l'urine recueillie sur une période de 24 h a révélé des différences plus frappantes lors de la comparaison des points temporels de l'ensemble de la population de sujets. La séparation claire de l'urine du jour 15 par rapport à l'urine du jour 30 est illustrée par le tracé des scores PLS-DA (Fig. 4A) et le modèle OPLS-DA (Fig. 4B). Le diagramme en S des charges OPLS-DA (Fig. 4C) a révélé quatre métabolites urinaires élevés, dont l'amélioration était considérée comme un résultat direct de la consommation de raisin, en ce sens qu'ils étaient tous réduits après 30 jours supplémentaires de régime sans raisin.

L'acide tartrique a été le plus profondément augmenté (quintuple, p < 0,0001). En tant que composant du raisin lui-même, cela peut être considéré comme un bon indicateur pour surveiller la consommation de raisin ou la conformité alimentaire. L'acide 2'-désoxyribonique (+ 26 %, P = 0,009) était également élevé par la consommation de raisin. Ce métabolite est dérivé de l'hydrolyse de la 2′-désoxyribonolactone, qui est formée dans l'ADN par l'oxydation du 2′-désoxyribose au niveau des sites abasiques, la lésion de l'ADN la plus fréquente se produisant à raison de milliers par cellule et par jour. Ce processus se produit préférentiellement aux sites de réplication de l'ADN où le simple brin d'ADN en retard est le plus vulnérable, en particulier à la dépurination47. La 2′-désoxyribonolactone est libérée à partir de l'ADN duplex avec une demi-vie de 32 à 54 h, mais plus rapidement à partir de l'ADN simple brin avec une demi-vie d'environ 20 h48. Par conséquent, l'élévation de l'acide 2′-désoxyribonique après la consommation de raisin peut être une accumulation d'événements se produisant au cours de plusieurs jours précédents. Il est également possible que ce processus représente une dépurination naturelle de l'ADN dont la réparation est renforcée par un ou plusieurs constituants du raisin. De plus, dans deux enquêtes précédemment rapportées sur l'administration de raisin à des souris, nous avons également observé des élévations d'acide 2′-désoxyribonique associées à l'administration d'un régime de raisin6,12, et une variation interindividuelle a été observée dans des études d'intervention humaine49.

De plus, l'acide glutaconique, un autre composé à 5 carbones dérivé du glutamate, s'est également avéré être élevé après la consommation de raisin (+ 26 %, p = 0,004). L'acide 3-hydroxyphénylacétique, lié au métabolisme de la tyrosine, était également élevé (+ 44 %, p = 0,002). En revanche, l'excrétion urinaire de deux substances liées au métabolisme du microbiote intestinal, l'acide 3-indoleacétique et l'acide hippurique, a été diminuée, ainsi que la valine, le ribose, l'acide 2,3-dihydroxybutanoïque, le galactose, le glucose, l'acide carbamique, l'acide malonique et le lévoglucosan.

Une étude de la littérature a révélé que l'origine bactérienne de l'acide glutaconique implique Clostridium symbiosum50 et que l'origine bactérienne de l'acide 3-hydroxyphénylacétique implique Parabacteroides spp.51, Clostridia spp.52 ou Klebsiella pneumoniae53. Ces espèces ne sont pas incluses dans le tableau 1 qui résume les principales modifications taxonomiques et, en fait, des analyses ultérieures ont révélé que ces espèces n'étaient pas significativement différentes le jour 15 par rapport au jour 30 dans cette population d'étude (supplément 5). Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour clarifier ces questions, mais cette dichotomie illustre la valeur de la métabolomique par rapport à la microbiomique pour définir la production réelle de métabolites potentiellement bioactifs.

L'analyse du tracé des scores PLS-DA pour l'urine du jour 30 par rapport à l'urine du jour 60 (Fig. 5A) et la modélisation OPLS-DA (Fig. 5B) ont montré une séparation encore plus nette des scores. Dans le diagramme en S des charges OPLS-DA (Fig. 5C), un métabolite urinaire a été élevé par le retour au régime restreint et, comme indiqué ci-dessus, les métabolites après l'ajout de raisin au régime ont été diminués.

Enfin, comme mentionné ci-dessus et illustré sur la figure 6, il est clair que la variation individuelle sera discernée dans un groupe d'êtres humains vivant librement. Pour les besoins de cette étude, la population sujette a accepté des restrictions alimentaires et de style de vie (suppléments 6 et 7) afin que nous puissions accéder le plus précisément possible à l'impact de la consommation de raisin. Cela ne veut pas dire, cependant, que nous nous attendions à ce que les individus répondent de manière complètement homogène. Sur la base de ces considérations, nous avons pensé qu'il serait intéressant de séparer un segment spécifique de la population étudiée, initialement basé sur les profils taxonomiques du microbiome, et de comparer ce groupe sélectionné avec les autres participants à l'étude en utilisant la même méthodologie.

Sur les 29 participants qui ont terminé l'étude, 11 sujets ont été sélectionnés sur la base de changements de profil uniques de genre et d'espèce lors de la comparaison des trois points dans le temps (Fig. 6). Comme pour le groupe dans son ensemble, aucune différence significative n'a été trouvée dans la diversité alpha et bêta du microbiome des 11 sujets sélectionnés. Cependant, à chaque comparaison de temps (15 contre 30 ; 15 contre 60 ; 30 contre 60), des différences significatives ont été découvertes lorsque les 11 sujets sélectionnés ont été comparés aux 18 sujets restants en termes de taxonomie, de niveaux d'enzymes et d'analyse de la voie KEGG (supplément 3). Confirmant la signification fonctionnelle de ces différences, au jour 30 (après la consommation de raisin), une séparation claire a été observée à l'aide de l'OPLS-DA, à la fois avec des échantillons de plasma (Fig. 7A) et d'urine (Fig. 7B). La nature chimique complète de ces changements métaboliques reste à caractériser. Jusqu'à présent, notre analyse des métabolites plasmatiques et urinaires jugés provenir du microbiote n'a donné que l'identité du myo-inositol dans le plasma, qui était quelque peu diminuée (p = 0,03) (supplément 4).

En somme, les données présentées ici démontrent que la consommation de raisin ne perturbe pas l'état eubiotique du microbiome chez des sujets humains normaux et en bonne santé. La consommation de raisin modifie la composition taxonomique du microbiome, les niveaux d'enzymes, les voies KEGG et le métabolome. Comme c'est souvent le cas avec les travaux impliquant un groupe hétérogène d'êtres humains vivant en liberté, la variation interindividuelle a été démontrée par une sous-analyse de la population étudiée. Cependant, avec le groupe d'étude dans son ensemble, des changements médiés par la consommation de raisins ont été observés et on peut s'attendre à ce qu'ils s'appliquent largement. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si ces réponses sont responsables ou liées à l'un des avantages pour la santé associés aux raisins, bien qu'il semble logique de s'attendre à ce que des changements de ce type soient suffisamment profonds pour avoir une signification.

L'objectif de cette étude était de déterminer l'effet potentiel de la consommation de raisin sur le microbiome, sur la base de la composition microbienne du microbiome et des analyses métabolomiques. Afin de tenter d'éliminer autant de facteurs de confusion que possible, les sujets devaient répondre aux critères d'inclusion/exclusion décrits dans le supplément 6. Les sujets répondant aux critères, la nature globale de l'étude a été discutée. En particulier, les restrictions relatives au régime alimentaire et aux suppléments associés à l'étude (décrites dans le supplément 7) ont été examinées et les sujets ont reçu un numéro de contact pour poser toute question relative à la nourriture autorisée. À ce stade, les sujets signant un document de consentement éclairé ont été inscrits à l'étude.

Le jour 1 de l'étude, les sujets ont reçu le premier kit de prélèvement d'échantillons fécaux et ont commencé le régime alimentaire de l'étude. Il leur a été demandé de prélever un échantillon fécal au jour 13/14 et de retourner le kit de test contenant l'échantillon au jour 15 (± 2 jours). De plus, les sujets ont été invités à jeûner pendant une période de 12 h avant de retourner l'échantillon fécal au jour 15, dans la mesure où le plasma serait également préparé ce jour-là.

Le jour 1 de l'étude, les sujets ont également reçu un récipient de collecte d'urine. Le ou vers le jour 14 de l'étude, chaque volontaire a recueilli un échantillon d'urine complet de 0 à 24 h. Pendant la période de prélèvement à domicile, l'échantillon était réfrigéré entre et après chaque prélèvement.

Au jour 15 de l'étude, les premiers kits de test fécaux ont été reçus. Tous les échantillons fécaux ont été collectés, enregistrés et préparés pour l'expédition conformément aux directives de Diversigen. Dans les 24 h, les échantillons ont été envoyés à Diversigen (New Brighton, MN) pour analyse par courrier express.

De plus, les premières bouteilles d'échantillons d'urine ont été reçues et secouées à la main pour assurer l'homogénéité. Le volume a été mesuré en ml et enregistré. Cinq ml ont été transférés dans des tubes Falcon de 15 ml, étiquetés avec le code du sujet, la date et l'heure et le volume d'urine de 24 h, et congelés à - 20 ° C avant l'analyse.

Les sujets ont reçu le deuxième kit de test fécal, un deuxième récipient de collecte d'urine et suffisamment de poudre de raisin pour durer toute la durée de la période de consommation de poudre de raisin de deux semaines. En plus de fournir des fiches d'instructions (supplément 8), les sujets ont reçu des instructions sur la façon d'utiliser la poudre pendant l'étude. Juste avant la consommation, les sujets ont mélangé la poudre de raisin (36 g) avec environ 6 oz d'eau. Cela a été fait deux fois par jour (une fois le matin et l'après-midi/soir) pendant 14 jours. En cas d'oubli d'une dose, les sujets étaient informés qu'ils devaient la prendre dès que possible. Les sujets ont reçu un journal quotidien dans lequel enregistrer l'utilisation du produit et ont reçu pour instruction d'apporter les sachets de poudre vides à enregistrer pour conformité au jour 30 (± 2 jours).

Enfin, au moins 7 ml de sang total ont été prélevés dans un tube Vacutainer hépariné de 10 ml (contenant de l'héparine de sodium) et placés sur de la glace jusqu'à centrifugation à 4 ° C pendant au moins 15 min à 2200–2500 tr / min. À l'aide d'une pipette Pasteur en verre (à usage unique), la couche de plasma supérieure (3 ml) a été soigneusement retirée sans transférer de globules rouges et placée dans un tube en plastique à bouchon vissé, étiqueté avec le code du sujet, la date et l'heure. Les échantillons ont été stockés à - 20 ° C avant les analyses.

Au jour 30 de l'étude, les sujets ont rendu le deuxième kit de test fécal contenant un échantillon qui avait été collecté dans un passé récent et une collecte d'urine de 24 heures. Les échantillons ont été traités et stockés comme décrit ci-dessus. Les sachets vides qui contenaient auparavant la poudre de raisin ont été rendus et les sujets ont été interrogés sur leur expérience. Les événements indésirables ont été signalés.

Le sang total a été recueilli et le plasma a été préparé comme décrit ci-dessus. Avant chaque prélèvement sanguin, les sujets ont confirmé qu'ils avaient jeûné pendant au moins les 12 dernières heures. Les sujets ont reçu le troisième kit de prélèvement d'échantillons fécaux et le troisième récipient de collecte d'urine, et ils ont poursuivi le régime d'étude sans raisin et le régime sans médicament pendant une période de sevrage de quatre semaines.

Au jour 60 (± 2 jours), les sujets ont rendu leurs derniers échantillons fécaux et d'urine qui ont été préparés pour l'analyse, et les échantillons finaux de plasma ont été collectés.

Pour assurer la cohérence et la continuité des recherches expérimentales et cliniques concernant le potentiel biologique et physiologique du raisin, une poudre lyophilisée est fabriquée sous les auspices de la California Table Grape Commission (Fresno, CA)54. La poudre de raisin, qui sert de substitut aux raisins frais, est composée de raisins rouges, verts et noirs frais, pépins et sans pépins, qui sont broyés et lyophilisés pour conserver leurs composés bioactifs. La poudre est préparée en utilisant de bonnes procédures de fabrication pour les aliments. Une assurance qualité supplémentaire est fournie en s'assurant que le produit est exempt de contaminants grâce à des analyses microbiennes. De plus, le produit est soumis à une normalisation chimique pour la quantification des principaux constituants phytochimiques54. Pour les études en cours, des sachets scellés sous vide contenant 36 g de poudre de raisin lyophilisée standardisée ont été fournis et conservés à − 20 °C jusqu'à utilisation.

Quarante et un (41) sujets ont été inscrits à l'étude et 29 sujets (70,7 %) ont terminé l'étude. Douze (12) sujets (29,3 %) ont abandonné l'étude. Cinq (5) sujets (12,2%) ont retiré leur consentement, 3 sujets (7,3%) ont été perdus de vue, 2 sujets (4,9%) étaient dus à des EI (nécessité de médicaments d'exclusion et symptômes du Covid-19) et 2 sujets (4,9%) étaient dus à Autre (médicament d'exclusion et positif au Covid-19).

L'âge moyen (écart-type [ET]) des sujets était de 39,8 (9,6) ans, l'âge médian étant de 40,0 ans et les âges minimum et maximum étant respectivement de 20,9 à 55,7 ans. Vingt-deux (22) sujets (53,7 %) étaient des femmes et 19 sujets (46,3) étaient des hommes. La race des sujets comprenait Blanc/Caucasien (40 sujets, 97,6 %) et Autre (1 sujet, 2,4 %). La majorité des sujets, 29 (70,7%), n'étaient ni hispaniques ni latinos et 12 (29,3%) étaient hispaniques ou latinos.

Le protocole d'étude, les informations sur le sujet et le formulaire de consentement éclairé (ICF) et d'autres informations écrites sur le sujet ont été examinés et approuvés par l'Institutional Review Board (IRB) IntegReview, 3815 S. Capital of Texas Hwy, Suite 320, Austin, TX 78 704, Téléphone : 512 - 326-3001, Fax : 512-697-0085, http://www.integreview.com.

Toutes les recherches ont été effectuées conformément aux directives et réglementations pertinentes ; le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants.

Les échantillons ont été extraits avec PowerSoil Pro (Qiagen) automatisé pour un débit élevé sur le QiaCube HT (Qiagen), en utilisant des plaques Powerbead Pro (Qiagen) avec des billes de céramique de 0,5 mm et 0,1 mm.

Les échantillons ont été quantifiés avec le test d'ADN double brin Quant-iT PicoGreen (Invitrogen).

Les bibliothèques ont été préparées avec une procédure adaptée du kit Illumina DNA Prep (Illumina). Pour BoosterShot® (Shallow Sequencing, 2 M lectures/échantillon), les bibliothèques ont été séquencées sur un Illumina NovaSeq en utilisant une seule extrémité 1 × 100 lectures (Illumina).

Les séquences d'ADN ont été filtrées pour une faible qualité (Q-Score < 30) et une longueur (< 50), et les séquences adaptatrices ont été coupées à l'aide de cutadapt. Les lectures de séquences d'hôtes humains ont été supprimées à l'aide de Bowtie2.

Les séquences ont été coupées à une longueur maximale de 100 pb avant l'alignement et converties en un seul fasta à l'aide de shi7. Les séquences d'ADN ont été alignées sur une base de données organisée contenant des génomes représentatifs dans RefSeq pour les bactéries avec des souches supplémentaires sélectionnées manuellement (Venti). Les alignements ont été réalisés à 97 % d'identité par rapport à tous les génomes de référence. Chaque séquence d'entrée a été comparée à chaque séquence de référence dans la base de données Venti de Diversigen en utilisant un alignement entièrement espacé avec BURST. Les liens ont été rompus en minimisant le nombre total d'unités taxonomiques opérationnelles (OTU) uniques. Pour l'attribution de la taxonomie, chaque séquence d'entrée s'est vu attribuer l'ancêtre commun le plus bas qui était cohérent sur au moins 80 % de toutes les séquences de référence à égalité pour le meilleur résultat. Les échantillons avec moins de 10 000 séquences ont également été rejetés. Les OTU représentant moins d'un millionième de tous les marqueurs au niveau de l'espèce et celles dont moins de 0,01 % de leurs régions génomiques uniques sont couvertes (et < 1 % de l'ensemble du génome) ont été rejetées. Le nombre de comptes pour chaque OTU a été normalisé à la longueur moyenne du génome. Les données de comptage ont ensuite été converties en abondance relative pour chaque échantillon. Les tableaux normalisés et filtrés ont été utilisés pour toutes les analyses en aval.

Les groupes d'orthologie de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG KO) ont été observés directement en utilisant un alignement à 97 % d'identité par rapport à une base de données de gènes dérivée de la base de données de souches Venti. Pour construire cette base de données, une souche représentative de chaque espèce dans la base de données Venti a été annotée à l'aide de Prokka (v 1.12). Les annotations Prokka ont été croisées avec les identifiants KEGG, et les séquences de gènes avec les annotations KEGG ont été conservées pour être utilisées dans la base de données fonctionnelle. La table KO et les tables en aval contiennent les comptages KO directement observés convertis en abondance relative dans un échantillon. Les KO ont été regroupés en voies KEGG de niveau 2 et -3 et en modules KEGG (www.kegg.jp/kegg/kegg1.html).

L'indice Chao1, l'indice de Shannon et le nombre d'OTU observés (groupe taxonomique) ont été calculés à l'aide d'un tableau taxonomique raréfié et filtré défini sur la profondeur minimale autorisée pour un échantillon (10 000) à l'aide de QIIME 1.9.1. Les mesures de la diversité bêta de Bray – Curtis ont été calculées à partir de la taxonomie filtrée et de l'abondance relative du module KEGG / enzyme à l'aide de QIIME 1.9.1.2.

Tout d'abord, 24 échantillons de contrôle qualité (CQ) ont été préparés en regroupant des aliquotes de 50 μL de tous les échantillons de plasma. Étant donné que plusieurs tests devaient être effectués sur chaque échantillon et pour éviter les congélations et décongélations répétitives, chaque échantillon a été divisé en aliquotes de 200 μL et stocké dans des tubes Eppendorf. Les échantillons ont été étiquetés 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C…, où # = ID du sujet et A = Jour 15 (± 2 jours), B = Jour 30 (± 2 jours) et C = Jour 60 (± 2 jours). Les échantillons ont été conservés à - 20 °C. Tous les échantillons ont été analysés en double et avec les échantillons QC. Ceux-ci ont été analysés sur sept jours consécutifs par lots de 30 et dans un ordre qui avait été randomisé. Par conséquent, le plus souvent, des doubles d'échantillons de plasma ont été analysés à des jours différents. Les échantillons ont été dérivés avec BSTFA/TMCS et analysés avec un système GC-MS Agilent en utilisant nos méthodes décrites précédemment12. Les pics chromatographiques ont été identifiés à l'aide d'AutoQuant (Agilent) qui a comparé leurs spectres de masse avec la bibliothèque spectrale NIST 14 de 242 466 spectres de masse. En cas d'ambiguïté où des métabolites apparentés produisaient des spectres de masse similaires, par exemple les sucres isomères glucose, galactose, fructose et mannose, des étalons authentiques ont été utilisés et les pics identifiés à partir de leurs temps de rétention sur la colonne de chromatographie en phase gazeuse. Certains composants ont produit plus d'un dérivé (et donc un pic chromatographique), qui ont été additionnés. La concentration relative de chaque métabolite a été déterminée à partir du rapport de sa surface de pic à la surface de pic de l'acide 4-chlorophénylacétique standard interne. Une feuille de calcul Excel a ensuite été construite à l'aide de Quant Browser qui contenait le rapport de surface de pic (concentration relative) de tous les métabolites identifiés dans tous les échantillons. Cette matrice de données a été importée dans SIMCA 17 afin de procéder à une analyse multivariée des données.

Premièrement, en raison de sa prédominance bien établie dans les chromatogrammes GC-MS d'urine dérivée, l'urée a été retirée de tous les échantillons d'urine par incubation avec de l'uréase de haricot Jack. Il a été rapporté que cette procédure augmentait le nombre de métabolites détectés dans l'urine et réduisait leur coefficient de variation55. À tous autres égards, les échantillons d'urine ont été analysés pendant sept jours consécutifs par les mêmes procédures que les échantillons de plasma.

Cette analyse est également connue sous le nom d'analyse discriminante par projection sur les structures latentes. Il s'agit d'une analyse de données multivariée supervisée, ce qui signifie que la classe de chaque échantillon est incluse dans l'analyse. PLS-DA et d'autres méthodes supervisées sont facilement sujettes à une surmodélisation des données. Pour intercepter une telle sur-modélisation, les modèles PLS-DA ont été soumis à une méthodologie de validation utilisant un protocole de non-participation avec 200 permutations. La décroissance des valeurs R2 (corrélation) et Q2 (prévisibilité) en dessous de 0,3 et 0, respectivement, donne l'assurance que les données n'ont pas été surmodélisées dans l'analyse PLS-DA.

Cette analyse réduit la dimensionnalité des tracés des scores PLS-DA. Charges OPLS-DA conséquentes Les diagrammes en S montrent les métabolites déterminés par GC-MS en relation avec leur abondance relative (axe X) et leur corrélation avec le modèle OPLS-DA (axe Y). Les charges dans le quadrant supérieur droit représentent les métabolites qui sont régulés à la hausse dans le groupe test et celles dans le quadrant inférieur gauche représentent les métabolites qui sont régulés à la baisse dans le groupe test. Les charges qui chevauchent le point graphique (0,0) représentent des métabolites qui ne sont pas liés à la manipulation expérimentale, par exemple, un changement de régime alimentaire.

Après avoir généré les ensembles de données décrits ci-dessus, l'inspection visuelle des parcelles empilées d'espèces microbiennes a montré des changements de profil individuels uniques (Figs. 1A et 6A). Ceci, combiné aux différences les plus élevées observées dans les coordonnées géométriques des parcelles PCA [Supplément 2, Fig. S2 panneaux D(i)-D(vi)] a conduit à la sélection de 11 sujets (six femmes et cinq hommes). Des sous-analyses ont été effectuées en comparant ces 11 sujets sélectionnés avec les 18 sujets restants en utilisant la même méthodologie que celle décrite ci-dessus.

Pour déterminer la signification statistique entre les groupes au fil du temps, des tests t appariés ont été effectués à l'aide de Microsoft Excel. De plus, les valeurs de Cohen d (taille de l'effet) ont été calculées pour comparer différents groupes56. L'analyse univariée des données (test de rang signé des paires appariées de Wilcoxon) a été réalisée à l'aide de GraphPad Prism 9.3.1 pour l'analyse de la métabolomique GC – MS. La signification statistique a été définie à un niveau de p < 0,05, bien que dans certains cas, des valeurs de p comprises entre 0,05 et 0,10 soient rapportées avec la taille d'effet D de Cohen56. Des méthodes supplémentaires d'analyses statistiques sont incluses dans le texte.

Avec des sujets répondant aux critères d'inscription, la nature globale de cette étude a été discutée en détail. Cela comprenait les restrictions alimentaires et les suppléments associés à l'étude. Les sujets ont reçu un numéro de contact pour poser des questions. Seuls les sujets signant un document de consentement éclairé ont été inscrits à l'étude.

Le protocole d'étude, les informations sur le sujet et le formulaire de consentement éclairé (ICF) et d'autres informations écrites sur le sujet ont été examinés et approuvés par l'Institutional Review Board (IRB) IntegReview, 3815 S. Capital of Texas Hwy, Suite 320, Austin, TX 78704, Téléphone : 512-326-3001, Fax : 512-697-0085, http://www.integreview.com.

Toutes les recherches ont été effectuées conformément aux directives et réglementations pertinentes ; le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants.

Les ensembles de données générés et analysés pour la présente étude sont disponibles dans le référentiel du National Center for Biotechnology Information (NCBI), numéro d'accès PRJNA882649.

Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes

Peptide synthétase non ribosomique

Analyse des composants principaux

Analyse des coordonnées principales

Acides gras à chaîne courte

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Les auteurs sont reconnaissants à TKL Research, Inc., 1 Promenade Boulevard, Suite 1201, Fair Lawn, NJ 07410, pour la gestion du recrutement des sujets et la collecte des échantillons cliniques.

Ce travail a été soutenu en partie par la California Table Grape Commission. Le commanditaire n'a pas été impliqué : dans la préparation de l'article ; dans la collecte, l'analyse et l'interprétation des données ; dans la rédaction du rapport ; et dans la décision de soumettre cet article pour publication.

Programme d'immunologie, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, 10065, États-Unis

Asim Dave

Collège de pharmacie et des sciences de la santé, Western New England University, 1215 Wilbraham Rd., Springfield, MA, 01119, États-Unis

Réalisateur Beyoğlu, Jeffrey R. Idle & John M. Pezzuto

Division des sciences pharmaceutiques, Arnold & Marie Schwartz College of Pharmacy and Health Sciences, Long Island University, Brooklyn, NY, 11201, États-Unis

Parc Eun Jung

Département de médecine, UMass Chan Medical School—Baystate, Springfield, MA, 01199, États-Unis

John M. Pezzuto

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Conceptualisation, AD, E.-JP, DB, JRI et JMP ; méthodologie, AD, E.-JP, DB, JRI et JMP ; logiciels, AD, E.-JP et DB ; validation, AD, E.-JP, DB, JRI et JMP ; analyse formelle, AD, E.-JP, DB, JRI et JMP ; enquête, AD, E.-JP et DB ; ressources, JMP et JRI ; curation des données, AD, E.-JP, DB, JRI et JMP ; rédaction—préparation du brouillon original, AD, E.-JP et JMP ; rédaction-révision et édition, AD, E.-JP, DB, JRI et JMP ; visualisation, AD, E.-JP, DB, JRI et JMP ; surveillance, E.-JP. JRI et JMP ; administration de projets, JRI et JMP ; acquisition de financement, JRI, DB et JMP Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Correspondance à John M. Pezzuto.

JMP siège au comité consultatif scientifique de la California Table Grape Commission. Tous les autres auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts concurrents.

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Réimpressions et autorisations

Dave, A., Beyoğlu, D., Park, EJ. et coll. Influence de la consommation de raisin sur le microbiome humain. Sci Rep 13, 7706 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34813-5

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Reçu : 22 septembre 2022

Accepté : 08 mai 2023

Publié: 12 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34813-5

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